关于从人体移植钛涂层聚丙烯手术网片的降解特征

NicholasT. H. Farr   ^1,2 | BerndKlosterhalfen ³ | Günter K. Noé ⁴

1 英国谢菲尔德大学材料科学与工程系

2英国谢菲尔德Insignio电子医学研究所

3 德国杜伦医院病理学研究所

4 德国多马根维藤/黑尔德克大学Rheinland诊所妇产科

——《生物医学材料研究杂志B辑》；应用生物材料第111卷第5期2023 ；1-11

Ø 概要：

钛涂层聚丙烯（Ti-PP）网片于2002年作为手术网片引进用于治疗疝气，不久后也在盆底手术中应用，目的是与非钛化/常规PP网片相比改善生物相容性，钛涂层的应用也有利于解决PP在体内环境中暴露的顾虑。许多研究显示PP虽被广泛作为稳定的化合物，但易受到氧化和分解，进而影响到机械特性，即PP网片的坚韧和弹性。尽管Ti-pp外科网片有广泛临床应用，但尚未有调查临床植入和后续取出网片材料的留存性能的研究。这篇研究中观察了体内取出的放置不同时长的两例Ti-pp网片。材料分析所涉及的技术手段包括：衰减全反射傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR), 拉曼光谱和扫描电子显微镜 (LV-SEM), 背散射电子成像(BSE)，能量色散X射线光谱仪(EDS)和二次选择高光谱成像(SEHI)。本文的假设是Ti涂层成功屏蔽了PP网片体内的氧化压力并避免降解。本文结果第一次显示了取出的Ti-pp网片本体氧化、表面降解和环境压力开裂的证据。

关键词：降解，材料特性，氧化，盆底器官脱垂，PP网片，压力性尿失禁，钛涂层，经阴网片，钛网片。

Ø 介绍

PP外科网片从1950年代开始使用于腹壁疝、切口疝及腹股沟疝。70年代，妇科医生开始使用网片治疗盆腔器官脱垂（POP），20年后，PP网片开始用来治疗压力性尿失禁（SUI）。与此同时，经阴道采用PP网片修补POP（TVM）也首次开始了应用。因为PP生物稳定性有限，目前网片会合成有各种添加剂，如抗氧化剂。取出的PP网片经常被报道有表面改变如碎裂和脱落。 PP网片的降解被认为是腐蚀性化学物质，如炎症细胞产生的活性氧化物（ROS），和网丝纤维拉力在体内协同作用的结果。降解的PP网片具有降低的拉伸强度和弹性模量，网片表面的形态改变也影响网片与免疫细胞的相互作用。因此，对PP网片长期安全性的关注正在增长。

钛作为植入材料因其抗腐蚀性和组织相容性广泛应用于牙科和小骨植入物或膝髋关节假体，钛因缺乏柔性和延展性无法直接用作网片材料，意图改善生物相容性的钛涂层的PP网片纤维因此得以发明。钛涂层聚丙烯（Ti-PP）网片于2002年作为手术网片引入，最初用于治疗疝气，不久后也在盆底手术中应用，据称，Ti-PP网片具有均匀的Ti涂层，其与PP网片纤维共价键合。本文的假设是Ti涂层成功屏蔽了PP网片在体内的氧化压力并避免降解。根据作者目前所知，目前还没有有关Ti-PP植入后研究。但是根据患者年龄和其它的因素，它作为长期植入物植入10-50年是得到许可的。

    本研究因此评估了两个接受盆底手术患者体内取出的Ti-PP网片样本的材料特征。网片是在体内不同时长后因复发取出的。根据ISO 10993-18标准，在不同尺度以一系列的分析手段进行了研究。本体氧化使用衰减全反射傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)，表面形态降解使用拉曼光谱和扫描电子显微镜 (LV-SEM)和背散射电子成像(BSE)，表面化学分析使用能量色散X射线光谱仪(EDS) 和二次选择高光谱成像(SEHI)。目的是研究是否钛涂层能防止PP网片在体内的降解。另外，本研究中收集的数据与其他研究中获得的PP网片数据进行了比较。

Ø 材料和方法

2.1 材料

植入女性盆底的两个Ti-PP网片，在大约6个月（short-term ST）和24个月（Long-term LT）后因复发取出，在德国Witten Herdecke大学的RheinlandclinicsDormagen医院进行了检测。根据德国Düren 医院病理学研究所的病理报告，两个网片的组织样本均显示出持续强烈的异物反应，伴有严重的纤维化和明显可视的网片皱缩（图1）。没有低度或高度感染，也没有改变的神经结构。当用偏振光检查时，两个网片都显示出明显的网片降解（图2）。与植入时间相应，ST网片显示轻微降解，而LT网片显示高度降解。

材料特征分析之前，取出的Ti-PP网片按此前设定的清洗程序已经彻底移除了粘附于网片表面的生物组织。简单讲，样品以含蛋白酶(Alcalase®2.5L)的碱性溶液(pH 8.5–9.5)58℃处置12小时。氯化钠、表面活性剂SUPRALAN UF(Zschimmer & Schwarz, GER)和碳酸钠加入溶液来调整PH值。蛋白酶Alcalase®是丝氨酸内肽酶，主要含有枯草杆菌蛋白酶A，适于蛋白水解并对网片材料无害，也就是说，清洗过程不影响网片纤维。12小时的放置后以水漂洗。作为对照，Prolene®(Pristine PP)网片也在分析前同样以去离子水清洗。

2.2衰减全反射傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)

短期（ST）和长期（LT）植入Ti-pp网片样品和Pristine PP网片（Prolene®mesh，Ethicon）以 NICOLET 380 FTIR 光谱仪 (ThermoFisher Scientific, USA)分析。光谱采集前以干燥空气净化，范围为500至4000cm ^-1,平均32次扫描，分辨率4cm ^-1。使用了Golden Gate®带金刚石晶体的衰减全反射套件(Specac, UK) 以固态形式分析样品。

2.3能量色散X射线光谱仪

FEI Helios Nanolab G3扫描电子显微镜(FEI 公司, USA)装配了能量色散X射线光谱仪（EDS）探测器(Oxford仪器公司，UK），用来捕捉EDS光谱。EDS光谱取自每个Ti-pp网片纤维的中心，以减轻与纤维走行方向有关的任何影响。使用13nA探针电流，在10keV加速电压下，在5mm的工作距离处获得光谱。通过应用Aztec EDS分析软件自动化分析数据(Oxford仪器公司，UK）。

2.4低电压-SEM成像

FEIHelios Nanolab G3 (FEI 公司, USA) 和Helios G4 DualBeam   (ThermoFisher   Scientific, USA)显微镜观察两张取出的Ti-pp网片的表面形态学变化。与通常的SEM分析实践相反，样品之前没有用沉积做导电涂层处理。选择该方法有助于Ti-PP网片上的Ti涂层的显示。在10^-6毫巴范围内的典型真空室真空压力和4毫米的工作距离下，选择1–2 keV的加速电压，以避免样品因表面充电而损坏。Everhart–Thornley探测器（ETD）用于SE图像的低放大率，而穿透透镜探测器（TLD）用于高放大率SE图像

2.5 背散射电子成像

使用置于FEI Nova Nano 450 SEM（FEI公司，美国）内的同心背散射（CBS）检测器获得BSE图像。BSE选择是在2keV下进行的，在5mm的工作距离下，典型的室真空压力在10^-6mbar的范围内

2.6 二次电子高光谱

在之前的研究中，SEHI数据采集过程已经有过详细描述。^20，21简单地说，本研究中的SEHI生成是使用Helios Nanolab G3和Helios G4显微镜，在1 keV（单色）和50 pA浸没模式（模式II/UHR）的一致操作条件下进行的。这些显微镜能够在<1keV的电压下提供超高分辨率图像。为了确保拍摄真实材料表面的图像，与典型的SEM分析实践相比，没有将导电涂层涂覆到样品上。在分析时，在4mm的工作距离处保持10^-6毫巴的典型真空压力。通过调节镜电极电压（MV）以及150 V的管偏压设置，可以收集不同能量范围的SEHI。通过使用自动iFast采集方案，在15至15 V的范围内对MV进行步进。²²以0.5秒的帧间隔和0.5V的MV步长采集每个图像，对应于约0.2 eV的电子能量步长。使用Fiji ImageJ软件（ImageJ2，开源）进行图像处理

2.7 拉曼光谱

使用拉曼光谱（Renishaw inVia microRaman）分析Pristine PP网片和短期（ST）及长期（LT） Ti-PP网片取出物的的化学结构。拉曼光谱从位于网结部位远端的纵向纤维开始采集。选择50倍物镜，暴露10秒。激光功率设置为3Mw，分析点大小为1μm。Peltier冷却多通道CCD探测器采用2400线/mm衍射光栅，狭缝开口为65μm，光谱分辨率为大约1 cm ^-1。对于数据分析，使用OriginLab（OriginLab公司，美国）软件进行基线减法时未做平滑处理。

图1

长期（24个月）植入后的钛涂层聚丙烯（Ti-PP）网片组织的苏木精和伊红染色切片。显示出持续强烈的异物反应，伴有严重的纤维化和明显的网片皱缩和扭曲。请注意，多丝缝合材料在某些区域也可见（黑色星号）。组织切片中剩余的圆形，椭圆形或细长间隙来自网片纤维。

图2

用偏振光拍摄的明场图像以测试合成材料是否仍然存在并研究降解。图像来自长期植入的钛涂层聚丙烯（Ti-PP）网片。在中心，可以看到垂直切割的长纤维截面，由于降解（白色长箭头），材料侧方可见剥离或脱落。附近有两根卷曲纤维。还有几个可见的双折射合成碎片（橙色短箭头），mf，网片纤维，白色星号，网片纤维间隙。

Ø   结果与讨论

3.1通过ATR-FTIR光谱法定量本体氧化

为获得短期（ST）和长期（LT）取出的Ti-pp网片样本的本体氧化测量结果，使用了ATR-FTIR。根据ISO 10993-18:2020标准，FTIR被推荐用来确定医疗器械使用的合成化合物的化学结构。图3A显示了从 Pristine PP网片样品（Prolene®mesh，Ethicon）和两个取出的Ti-PP网片获得的FTIR光谱。和作为对照样本的Pristine PP相比，两个取出网片的FTIR光谱均显示出明显的羰基（CO：预期范围：1750–1500 cm ^-1)和羟基（OH：预期范围3600–3000 cm ^-1）基团。值得注意的是，LT网片显示，与ST网片相比，CO和OH基团均显著增加，而ST网片则与对照样本相比的相应显示出增加（图3B，C）。结果表明，尽管有Ti涂层，但大量PP本体在体内随着时间的推移逐渐氧化，这与先前对未覆盖涂层的PP网片的研究一致。长期以来，研究记录了PP的氧化，^23，24，其中包括在断链之前形成过氧化氢物（ROOH），随后形成醛、酮和羧酸，伴随着断链。⁴

这种氧化机制被用来解释PP体内降解，在断链之前形成过氧化氢（ROOH），随后形成羰基（CO）端基。^{4，17，26，27}该氧化途径与本研究中获得的数据一致。PP氧化对纤维性能的影响已被广泛考虑和研究，包括纤维龟裂/开裂、剥落、分子变化、弹性损失和脆化。^5,17,27此处显示的Ti-PP本体氧化证据清楚地表明，Ti涂层在体内不能阻止聚丙烯降解。

3.2 SEM、BSE和SE的表面形态成像评估

图3

（A） 从Pristine PP网片以及短期（ST）和长期（LT）取出的钛涂层聚丙烯（Ti-PP）网片（所有网片在2.1中描述）收集的衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）光谱，网片的两个光谱分别在1600 cm^-1和3400 cm^-1处显示羰基（CO）和羟基（OH）峰，其与对照样本相比增加。（B–C）显示叠加的局部光谱，（B）-OH峰在3600至3000 cm^-1之间积分，(C)-C=O峰在1850至1450 cm^-1之间。（i，ii）显示羰基和羟基的氧化产物.

为了评估两张Ti-pp网片的表面形态，（根据ISO10993-18的方法学）获取了一系列的SEM图像。对未涂层网片进行了分析，即，没有额外的导电涂层以直接观察Ti-pp网片的表面形态。为了减轻样品充电的影响并生成高度表面敏感的图像，采用了低电压SEM（1–2keV）成像和各种检测器设置，ETD和TLD均处于无场和浸没模式。结果图像如图4所示。

从图4中的图像可以看出，在两个Ti-PP网片上都明显发生了环境应力开裂（ESC）和表面裂解。Ti涂层不能防止PP的降解，这在SEM图像上通过纤维表面的裂缝和剥落可见。这种裂缝和剥落的观察结果与非钛化PP网片的研究结果一致.

网片降解对生物宿主反应的影响尚不清楚。然而，纳米至微米级别的PP颗粒的释放刺激细胞和免疫系统，或通过表面积增大促进炎症反应，这可以解释非钛化PP网片相对强的异物反应。此外，已知网片降解影响机械性能，即，刚度和拉伸强度。 ^4.30~34

当比较两个Ti-PP网片样品时，短期（ST）植入网片显示出比长期（LT）植入网片更少的环境应力开裂（ESC）和表面降解。还可以观察到，在LT网片的表面上容易发现明显的PP暴露区域，无论是在直纤维上还是在局部机械应力高的区域，即编织结点部位。值得注意的是，裂缝通常出现在Ti-pp网片纤维被编织结构扭转的纤维外侧表面。为了适应弯曲，纤维的内侧表面压缩，同时外表侧面拉伸。除外其他因素，这点可以解释材料表面形态为何在体内一段时间后不再稳定。

   为了更好观察表面降解做了BSE成像和高分辨率二次电子（SE）分析。（图5）SE成像是一种应用已久的基于SEM的表征方法，其对比度取决于材料的原子序数，原子序数越大，检测到的背散射电子越多。（图5A，B）

图4

短期（ST）和长期（LT）植入钛涂层聚丙烯（Ti-PP）网片的扫描电子显微镜（SEM）图像收集。

（A） ST网片的表面形态，存在表面畸变和碎裂区域。

（B，C）ST网片SE图像。值得注意的是，在Ti涂层中的破碎处可以看到没有改变表面结构的内部断裂，在本示例中，Ti涂层的宽度为750nm。

（D） LT网片的图像，和图像（B）比较显示LT网片区域具有更多的表面碎裂。

（E，F）ST网片的另一个高分辨率TLD图像。在图像（F）中，表面形态改变的区域代表暴露的PP。

（G）来自ST网片纤维的横截面。裂缝明显从左上到右下。该图像显示了Ti涂层的边界以及一些松散地粘附在表面的颗粒。

（H，I）与（E，F）类似，但是来自LT网片。与ST网片不同，LT网片的暴露PP区域位于远离受高应力影响的编织结点区域。这表明PP不仅暴露在高应力区域，可能存在导致氧化和表面改变的几种重叠机制。例如，已知由巨噬细胞分泌的过氧化物酶产生反应性氧化物质，这些物质已被认为在PP网片表面改变中起作用。

（J，M）分别显示来自LT和ST网片的TLD-SE图像。LT和ST临近暴露区域的高度碎片化，存在纵向裂纹，比较J和M可见碎裂模式异同点，（K，L）显示了不同比例下LT网片ESC和暴露的PP区域。

图5

收集短期（ST）和长期（LT）植入钛涂层聚丙烯（Ti-PP）网的二次电子（SE）和背散射电子（BSE）图像。（A） BSE图像取自与ST网片（B）中的插入SE图像相同的区域。在（A）中，红色箭头（i）-（v）表示Ti-PP表面退化的区域。（C） BSE图像取自与（D）中SE图像相同区域的LT网片。（C）中包含的红色圆圈突出了高BSE对比度的结构。（E） 特写SE图像LT网片的网片纤维显示出与网片纤维纵向垂直的密集表面裂纹图案。

图5A，B比较了短期（ST）网片的BSE和SE图像。图5A显示了高应力的编织结点周围的暴露区域，对照了图4所示的ETD图像。

图5A中的BSE图像显示了与SE图像相比更大的对比度变化（图5B）。最暗的BSE对比区域，如（i），出现在之前假设为暴露PP的区域中。该图像显示Ti涂层（ii）的脱落暴露出较低的原子序数材料，可能是PP。图5A（iii）指向的低对比度BSE发射区域，可能是暴露PP的区域，被类似于图5A（ii）中Ti涂层的高对比度区域包围，甚至更高的对比度区域主要存在于网片纤维互相接触的内部边缘（图5A-iv）。这些高BSE对比区域的化学成分是未知的，但这种表现的潜在解释是Ti涂层的降解。在图5A（iii）的区域内，存在稍高的BSE对比区域（图5A v）。该区域的对比度低于图5A（ii），因此不太可能与Ti涂层有关。因此认为该区域的结果可能与暴露的PP表面改变有关。

类似于图5A–D，相应地比较BSE图像和高分辨率SE图像。图5D显示了与图4所示图像相似的Ti-PP碎片区域。在图5C中，从图5D相同的区域拍摄的BSE图像显示了高BSE对比度结构的集合。这些明亮的对比结构的大小在1-10微米之间，位于高度碎裂的Ti-PP表面区域。图5E显示了高分辨率SE图像，其中有一些较暗的标记和开裂和错位的Ti涂层。如将更详细地讨论的，图5C中观察到的高对比度结构与图4D、J中错位的Ti涂层的结构相似，并且在BSE成像中显示为Ti表面碎片。

3.3通过EDS、SEHI和拉曼光谱表面/亚表面化学评估

为了评估两种移植的Ti-PP网片的表面化学性质，根据ISO 10993-18:2020的建议进行了能量色散X射线光谱分析，以鉴定医疗器械中的金属/合金（图S1）。然而，由于钛涂层厚度为30nm，使用EDS进行识别可能会有问题，EDS会在深度约2μm的区域内产生X射线。因此，我们还进行了二次电子高光谱成像（图6）和拉曼光谱，以确定化学结构/结晶度内的亚表面变化（图7）。

SEHI是一种新颖的、高度表面敏感的技术，已被证明能够区分碳质材料表面上的键^35–39，并提取有关金属氧化物表面功函数的信息²¹⁴⁰。图6A，B分别显示了从短期（ST）和长期（LT）网片中选择用于SEHI分析的感兴趣区域（ROI）的SE图像。这两张图片都显示ESC开裂，表面上似乎有暗痕。为了进行SEHI分析，选择了两个子ROI。这两幅图像中都突出显示为包含表面标记的紫色方框（如图4J所示）和包含看起来更洁净些的钛涂层的黑色方框。

图6

为短期（ST）和长期（LT）钛涂层聚丙烯（Ti-PP）网片的SEHI数据。

（A）（B）显示（D）和（E）中收集的SE光谱的敏感区域的相应SE图像。Ti-SE峰值先前已确定为4.9-5.3 eV，TiO的峰值范围为5.5-6.2 eV。（D）和（E）中的SE光谱均显示突出的Ti和TiO-SE峰值发射，与ST相比，LT表现出更大的TiO峰值。图像（C）显示了（B）的SEHI彩色图，其颜色SE范围如下：CHx的绿色=2.9-4.6eV，Ti/TiO的蓝色=5.1-6.4eV

图6D、E显示了生成的SE光谱（SES）。在之前发布的SEHI数据中，在4.9–5.3 eV处识别一个SE Ti峰，在5.5–6.2 eV的峰值范围内发现了Ti氧化物²⁰。收集的所有SES光谱中，这两个峰都很明显。因此，我们可以确认Ti仍然存在于两个移植的Ti-PP网片的表面上。SES光谱还显示了与Ti/Ti氧化物的存在相关的峰值位置的发射差异，比较了短期（ST）和长期（LT）植入物。这个结果很有趣，然而，推测Ti/TiO2涂层的表面变化不在本研究的范围内。

对于短期（ST）网片和长期（LT）网片，具有表面标记的紫色框比看起来涂层降解较少的黑色框包含更大的氧化钛SE峰值发射。该结果表明，Ti涂层上的标记可能是高度局部表面氧化的区域。图6E还强调了另一个感兴趣的SE峰值范围，即CH振动（CHx）。CHx先前已被鉴定为在2.9–4.3 eV的范围内显示出特征SE光谱。^35，36，41与短期（ST）网片相比，LT网片中CHx发射最丰富。SES的一个局限性是SE峰值通常会显示出与化学相关的重叠发射。这对于更高的能量发射（4–6 eV）是常见的，其不仅对钛氧化物敏感，而且对与有机材料中的氧官能团相关的峰也敏感。为了克服这一限制并更好地理解暗表面标记的组成，生成了用于LT网片分析的SEHI彩色图（图6C）。

SEHI图显示了钛涂层上的碳残留。值得注意的是，碳并没有局限于黑暗处的表面标记。此外，令人感兴趣的是，位于表面裂纹边缘的Ti涂层之间似乎是弦状结构。这些结构还显示出强烈的CHx发射。据认为，这种发射可能与PP中存在的烷基或无定形碳表面残留物的形式有关。

拉曼光谱用来识别PP骨干结构的结构单元内的变化。拉曼光谱是ISO 10993-18:2020中推荐用于测定合成聚合物的组成结构。图7显示了400–1600 cm范围内记录的PristinePP网片和短期（ST）和长期（LT） Ti PP网片的拉曼光谱¹。表1包含PP拉曼带的振动分配，已详细发表⁴²。Pristine PP网获得的光谱与先前发表的文献一致^43、44。在1000–1300cm ^-1范围内从PP获得的拉曼带不易分配，因为这些可能是由于各种芳香族伸缩模式或酯官能度的CO伸缩⁴⁵，如果没有更详细的分析就无法确认。先前已经确定808、841、972、995、1168 cm ^-1带与螺旋链结构相关⁴² 。当从标准的PP参考带972cm ^-1的相对强度来看时，这些带比率内的变化表明，与Pristine PP网片相比，以及在两个取出的Ti-PP网片之间对照，均有显著的螺旋结构变化。当检查808和840 cm ^-1的频带比时，可以看到这种变化的一个例子（图8）。这两条带已被证明与螺旋链的构象状态有关，并且先前已用于估计全同立构聚丙烯的结晶度^43，44。 808 cm ^-1与晶体内的螺旋链（r[CH3]和主链伸缩ν[CC]）有关^43，46，840 cm^-1分配给更短的螺旋构象的链。强度比I840/I808的增加与螺旋链断裂/异构缺陷有关^47，48。 C C耦合的损失导致侧基模r（CH3）的发射更大，表示为拉曼带从808到840 cm的位移，与短期（ST） TiPP网片和Pristine PP网片两者相比，长期（LT） Ti PP网片表现出更大的螺旋链缺陷。需要进行更详细的研究，包括对高应力节点位置的分析，以生成所需的数据，从而更好地来促进和理解观察到的结构缺陷的机制。

图7

Pristine PP网片（顶部）和短期（ST，中间）和长期（LT，底部）植入钛涂层聚丙烯（Ti-PP）网片的拉曼光谱。红色箭头指出PP网片和钛涂层聚丙烯（Ti-PP）网片的显著差别

通过断链过程的直接PP氧化途径能够使分子链碎裂。然而，机械化学的综合效应可能会发挥更重要的作用。机械应力产生的动能输入与氧化环境相结合，可能会对分子链降解产生更大的影响。²⁷将动能输入到植入的网状结构中，有可能为氧化降解过程创造更低的能量活化屏障。不仅通过分子链上的直接机械应力，而且可能还结合导热性，^49,50，这两者都可以降低聚合物降解所需的活化能。

表1

PP的拉曼光谱，不同官能团，不同构象的振动分配。

r, 摇摆;t, 扭曲; w, 晃动; δ, 弯曲; ν, 伸缩.

图8

在800–850 cm^-1Pristine PP网片和短期（ST）和长期（LT）移植钛涂层聚丙烯网片之间采集的拉曼光谱

Ø   推论

据作者所知，这是首次在取出的Ti-PP网片中检测到氧化和表面碎裂/降解的研究。所得结果与取出的无涂层聚丙烯网片的研究结果相似。考虑到现有数据，提出Ti涂层对表面和本体PP氧化速率降低具有未量化的短期效应。比较短期和长期移植的Ti-PP网片，这种减少是显著的。然而，正如这项研究所表明的，随着时间的推移，即使在最初的全Ti涂层中，环境应力开裂仍然存在，导致涂层的去除和PP的暴露，创造了潜在的网片氧化途径。因此，我们的研究结果表明，在Ti-PP网的终身植入过程中，预计会发生氧化，其模式与在未涂层PP网片观察到的模式相似。这些发现强调了未来研究的必要性，以加深对植入材料特性和植入环境的理解，从而开发出能够更好地终身植入耐受氧化和机械应力的材料。